ПЦР: есть ли проблема амплификации гомополимерных последовательностей?

jurius

По аналогии с ситуацией in vivo, могут ли ДНК-полимеразы типа Taq, Pfu и др. "проскальзывать" или, наоборот, "задерживаться" на гомополимерном участке или коротких повторах, приводя к инсерциям и делециям нуклеотидов при ПЦР?

sunlya

Да, могут. Во всяком случае, это одна из проблем при работе с дивергентной областью митохондриального генома кинетопластид - обилие GC повторов затрудняет амплификацию и, как следствие, секвенирование. ПЦР таких участков зачастую просто не идёт или очень низкокопийный продукт

yurimedvedev

А что, полимеразы устают делать много раз одно и то же? С чем связаны проблемы-то?

sunlya

Не совсем понятно. GCучастки для расплавления (в смысле, расплетания 2-ой цепочки) требуют больше энергии, чем АТ. Участки, обогащённые одним или 2-мя нуклеотидами имеют деформации в спиральной укладке, что затрудняет нормальную сборку макромолекулярного белкового комплекса для удвоения. К тому же на повторах в уже расплетёных дуплексах ДНК формируются шпильки и крестообразные фигуры. И фермент может просто дисоциировать с ДНК в начале шпильки и переприсоединиться в конце. Физически это рядом, но по длине кусок ДНК оказывается пропущенным. Ну и ещё некоторые причины

jurius

Cпасибо за комментарии
А низкокопийный продукт при ПЦР дивергентной области получается ожидаемого размера? Или больше похоже на шмер? Интересует, как такие повторы влияют на последовательность продукта.

zuzaka

короче, мораль такая: если есть подозрение на что-либо - не ограничивайтесь ПЦР, посетите хорошего венеролога

Arthur8

это было жестоко! =)
Оставить комментарий
Имя или ник:
Комментарий: