Как построить плазмиду для оверэкспрессии белка? Подскажите лит-ру

azamatuam

ПОдскажите, пожалуйста, где можно поботать материал касательно построения плазмид. Я так понимаю, что помимо гена белка, необходимо вставить "ампицилиновый" ген, галактозый или арабинозный промотор... Хотелось бы поподробнее об этом почитать, а то я недавно в микробиологической лабе работаю, до этого орг.синтезом занимался.

Lara_Fedorova

для этих целей существуют продажные плазмиды. типа pET32 (Novagen). там уже есть ген устойчивости к ампициллину и полилинкерный участок. там Т7 промотор вроде. вставляешь свой ген в плазмиду и экспрессируешь
почитай Патрушева
там все доступно изложено

sidorskys

Можешь амершамовский handbook почитать:
Recombinant Protein Purification Handbook - Principles and Methods
И эти статьи, например:
1. Makrides, S. C., Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli, Microbiol Rev., 60, 512-538 (1996).
2. Baneyx, F., Recombinant protein expression in Escherichia coli, Curr Opin Biotechnol, 10, 411-421 (1999)
3. Sorensen, H. P. and Mortensen, K. K., Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli, J Biotechnol, 115, 113-128 (2005)
А в основном, как тут выше сказали, используют плазмиды pET (с T7-промотором) и pGEX (с T5). Часто какой-нибудь таг на конец фермента довешивают, чтобы быстрее и проще чистить.
Ещё для T7 и сходных промоторов при оверэкспрессии всё чаще применяется метод автоиндукции:
Studier, F. W., Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures, Protein Expression and Purification, 41, 207-234 (2005).

azamatuam

Спасибо за статьи
Оставить комментарий
Имя или ник:
Комментарий: