Инактивация лигазы нагреванием

Andrey68

повышает или понижает эффективность трансформации E. coli лигазной смесью?
на молбиоле много всего разного пишут по этому поводу
http://molbiol.ru/protocol/09_06.html
Силекс пишет: "Для улучшения результатов трансформации, мы рекомендуем инактивировать лигазу прогреванием при 65 oC в течении 10-15 мин. Выход трансформантов существенно улучшается (выход может увеличиться в 100 раз)."
А Roche: "Heat inactivation should only be done if the ligation reaction
mixture is used in experiments other than transformation assays. Otherwise,
a drastic decrease of (> factor 20) transformants is possible."
Может, кто-то лично сталкивался с подобным? Пытаюсь разными способами повысить эффективность трансформации, вдруг кто-то что-то дельное посоветует

sunlya

А ты как трансформируешь? Порацией, солевая с/без хитшока, или что-то другое?

Andrey68

сорри, забыла написать
электропорацией

sunlya

У нас с лигазой проблем обычно не было - и инактивировать забывали, и просто переосаждали спиртом лигазную смесь - трансформировалось обычно хорошо. Посоветовала бы уменьшить объём лигазной смеси, если не переосаждаешь перед порацией, либо обязательно переосадить. Может, компетентные клетки перерастают? Их сама готовишь или юзаешь замороженные из стока?

Andrey68

>Их сама готовишь или юзаешь замороженные из стока?
юзаю замороженные, которые заранее готовлю
рутинная трансформация (какую-нибудь плазмиду размножить) с ними нормально идет, компетентность примерно 10^7 - 10^8
в целом задача такая: порезать геномную дрожжевую ДНК по HindIII и вставить в некий вектор, а затем этой лигазной смесью затрансформировать E.coli, отобрать клоны, содержащие оба маркера (дрожжевой и векторный и отсеквенировать вставку
проблема в том, что при трансформации клоны вырастают через раз и в весьма скромном количестве
по всей видимости, косяки либо в лигировании, либо в трансформации
причем несколько раз совпадало, что когда прогреваю лигазную смесь, трансформация не идет вообще. вот думаю, это суеверие или закономерность?

sidorskys

Честно говоря, у меня на количество трансформантов больше всего влияло количество вставки, причём при небольшом отклонении от оптимума в обе стороны разница была огромная.
компетентность примерно 10^7 - 10^8

А я-то думал при электропорации должно наступить полное счастье наподобие ^9-10.

Andrey68

я тоже так думала, но либо я компетентность неправильно определяю, либо нет в жизни щастья
поделись секретом, как сделать хорошие компетухи

Andrey68

а оптимум у тебя сколько?
я брала от 1:1 до 1:3 (вектор:вставка)

sidorskys

я тоже так думала, но либо я компетентность неправильно определяю, либо нет в жизни щастья
поделись секретом, как сделать хорошие компетухи

Даже химической трансформацией для Dh5alpha, Xl1blue etc обычно обещают до 5x10^8.
Правда, сам никогда компетентность не определял.
а оптимум у тебя сколько?
У меня был такой случай: 5,5 kbp + 0,7 kbp; 20 мкл; и получалось что-то вроде
100 ng + 40 ng - немного < 100 колоний
100 ng + 60 ng - тысячи
100 ng + 80 ng - сотни
 
Я правда оптимумы обычно не ищу, для большинства моих целей, если вырастет больше пары десятков колоний, то и хватит.

Andrey68

у меня Xl1blue, определяю компетентность следующим образом: к фасовке клеток 50 мкл добавляю 10 pg pDNA, электропорирую, подращиваю час в 500 мкл LB, высеваю на чашку 50 мкл.
считаю, что если выросло N колоний, то компетентность N*10^6 колоний/мкг. я нигде ничего не напутала?

sidorskys

проблема в том, что при трансформации клоны вырастают через раз и в весьма скромном количестве
по всей видимости, косяки либо в лигировании, либо в трансформации
А если просто вектор резануть по сайту и обратно сшить, что выйдет?

Andrey68

пару раз так сделала, вырастает несколько десятков колоний
т.е., с одной стороны, могло бы и больше вырасти (несколько сотен, например а с другой - меня одна-пять колоний на чашку в варианте со вставкой вполне бы устроили
тут мне в ПМ предлагают вектор дефосфорилировать перед лигированием, попробую

sidorskys

предлагают вектор дефосфорилировать перед лигированием
Это поможет против самолигирования (сайт у тебя, я так понял один т. е. против проблемы, когда растёт не то, а не когда вообще ничего особо не растёт.

Andrey68

есть подозрение, что вектор лигируется преимущественно сам на себя, без вставки
тогда на LB+Cm контроли вырастают нормально
а "опыт" я высеваю на LB+Cm+Amp, т.к. нужная мне вставка - с ампициллиновым маркером
т.е. "не то" росло бы, если бы ему не мешал ампициллин (и, кстати, растет иногда, было, что проверяю клон, выросший на двух антибиотиках, а в нем все равно нет вставки )

sunlya

А нужный кусок не может отрезаться Хиндом от ампициллинового маркера? Там между ними по сиквенсу ничего похожего на AAGCTT с разницей в 1-2 нуклеотида нет?

Andrey68

может, потому что о нужном куске (точнее, кусках, предполагается, что во всех случаях они разные) ничего не известно, кроме того, что он рядом с ампициллином

sunlya

А почему тогда именно Хиндом режете? Может, стоит попробовать другие рестриктазы? Раз сиквенса нет

Andrey68

из-за вектора
остальные рестриктазы либо режут вектор в нескольких местах, а не в одном, как нам удобно, либо у нас нет их в наличии
можно, конечно, найти другой вектор...

sunlya

Стоп, а полилинкер вектора только ОДИН рестриктный сайт несёт? Это что же за вектор? А попросить рестриктазы недостающие - в полилинкерах редко экзотические рестриктазы. На кафедре молбиологии у Колесникова (моего шефа) точно можно стрельнуть несколько единиц активности разных рестриктаз. Вектор стрельнуть - это чуть хуже - тебе ведь нужен без устойчивости к ампициллину, так? У нас все, которые я могу вспомнить, были именно с ним Зато плазмидками могут поделиться на молбиоле И рестриктазами тоже, кстати

Andrey68

нет-нет, может, я не очень точно выразилась, конечно же, не один
просто "исторически сложилось", что начали с Хинда, а поскольку проб много, то какую-нибудь другую рестриктазу (у меня перед глазами сейчас нет карты) проще сразу купить в нужном количестве, чем стрелять у разных людей
возможно, мы так и сделаем в итоге
просто, как мне кажется, смена рестриктазы вряд ли на что-то кардинально повлияет
хотя мб я не права и стоит попробовать
в любом случае, спасибо за все множество идей, которые Вы мне подсказали сегодня

Andrey68

Возвращаясь к теме топика...
На досуге поставила нехитрый опыт: трансформировала клетки одним и тем же количеством плазмиды в трех вариантах
1. просто плазмида :)
2. плазмида, порезанная хиндом и залигированная сама на себя
3. плазмида, порезанная хиндом и залигированная сама на себя, плюс инактивация лигазы нагреванием (65 градусов, 20 минут)
Если количество колоний, выросших в 1-м варианте, принять за 100%, то в 3-м варианте выросло 27%, а во 2-м варианте - 0,2%.
Так что вопрос снят, будем греть :)

sidorskys

2. плазмида, порезанная хиндом и залигированная сама на себя
3. плазмида, порезанная хиндом и залигированная сама на себя, плюс инактивация лигазы нагреванием (65 градусов, 20 минут)
Если количество колоний, выросших в 1-м варианте, принять за 100%, то в 3-м варианте выросло 27%, а во 2-м варианте - 0,2%.
Так что вопрос снят, будем греть :)
У тебя и так колоний мало, а получится в 135 раз меньше. :grin: Или я не так считаю? :confused:

sunlya

:) Теперь ждём параллельных трансформаций со встройкой с нагреванием и со встройкой без нагревания

Andrey68

вроде в 135 раз _больше_ будет, т.к. раньше я лигазную смесь обычно не прогревала
ps ох, знакомая картинка на аватаре :grin:

Andrey68

>Теперь ждём параллельных трансформаций со встройкой с нагреванием и со встройкой без нагревания
пока не заметила разницы по эффективности, по крайней мере, в своем случае

sunlya

Т.е. одинаково хорошо или одинаково плохо трансформируется с лигированной встройкой? Просто в начальных постах было, что встраивание-лигирование-прогревание-трансформация ничего хорошего несколько раз не давали. Сейчас без встраивания более-менее нормально. Я бы тогда сделала вывод, что дело во взаимоотношениях встройка-вектор

Andrey68

>Т.е. одинаково хорошо или одинаково плохо трансформируется с лигированной встройкой?
сложно сказать, _одинаково_ или нет, т.к. результат 0 (полное отсутствие клонов) или 1 (1-2 колонии)
одна колония меня вполне устраивает (10-20, допустим, вызывали бы подозрения уже)
если собирать примерную статистику, то в обоих случаях (без и с прогреванием лигазы) со вставкой у меня вырастает по 5-15 клонов с 20-40 чашек, а хотелось бы, в идеале, 20-40
>Я бы тогда сделала вывод, что дело во взаимоотношениях встройка-вектор
похоже на то
отфосфатазила и играюсь с соотношением и концентрациями теперь

Andrey68

проблема, кажется, решилась, довольно тупым способом: беру на трансформацию по 4 мкл лигазной смеси вместо 0,5-2 мкл (не пробивает вроде! ставлю параллельно несколько повторов и высеваю на одну чашку. результат: одна чашка - одна-две колонии.

sunlya

Теперь осталось найти у трансформантов нужную встройку, а не пустой маркер :) Надеюсь, что наконец-то получилось
Оставить комментарий
Имя или ник:
Комментарий: